что такое химерный ген

Метод молекулярно-генетической диагностики хронического миелолейкоза, позволяющий выявить в генетическом материале клеток крови или костного мозга мутантный ген, продукт деятельности которого играет ключевую роль в развитии этого заболевания.

Исследование клеток крови методом FISH (t (9; 22)/BCR/ABL), FISH анализ транслокации t(9;22) BCR-ABL.

BCR/ABL1 Translocation (9;22), FISH; Philadelphia Chromosome, BCR-ABL1 Fusion.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Наличие филадельфийской хромосомы исследуют в клетках периферической крови или костного мозга. При использовании крови её взятие производят обычным способом – посредством пункции вены и набора необходимого количества крови в вакутейнер. Взятие костного мозга проходит под местной анестезией, поэтому, если имеется аллергия на какой-либо местный анестетик, необходимо обязательно сообщить об этом доктору. После наступления анестезии врач специальной иглой производит пункцию кости (обычно из грудины или гребней подвздошных костей), шприцем аспирирует костный мозг и перемещает его в пробирку. Несмотря на анестезию, непосредственно в момент аспирации могут возникать болевые ощущения из-за перепада давления в полости кости. После манипуляции на место пункции накладывают асептическую повязку.

Стандартным методом для обнаружения описанной хромосомной аномалии является цитогенетическое исследование клеток костного мозга, однако оно не всегда позволяет выявить филадельфийскую хромосому, и в таких случаях рекомендуется более чувствительный анализ – FISH. Флюоресцентная in-situ гибридизация является молекулярно-генетическим исследованием, которое позволяет выявить в генетическом материале анализируемых клеток последовательность нуклеотидов, характерную для химерного гена BCR-ABL. Для этого применяются специальные последовательности ДНК, аналогичные участкам нормальных генов ABL и BCR, меченные флюоресцирующими веществами разных цветов – ДНК-зонды. В процессе анализа под воздействием высокой температуры и химических веществ двухцепочечные молекулы ДНК разделяются на отдельные цепи. Следующим этапом происходит гибридизация – соединение цепочек зондов с подходящими участками на клеточной ДНК. Результат гибридизации врач оценивает с помощью флюоресцентного микроскопа, который позволяет увидеть свечение, испускаемое присоединившимися к нативной ДНК зондами. При отсутствии транслокации каждый зонд присоединится к своей хромосоме и в микроскоп будут видны два разных и удаленных друг от друга свечения. Химерный ген BCR-ABL на 22-й хромосоме присоединит к себе оба зонда, и в микроскопе свечение будет исходить из одной точки, а его цвет поменяется на соответствующий комбинации двух исходных.

Для чего используется исследование?

Когда назначается исследование?

При отсутствии филадельфийской хромосомы по данным стандартного цитогенетического исследования или его недоступности:

Дифференциально-диагностические критерии уровней ответа на терапию ингибиторами тирозинкиназ, а также их интерпретация в качестве оптимального результата или неудачи лечения рассматриваются по утвержденным единым международным рекомендациям.

Что означают результаты?

Помимо исследования наличия BCR-ABL в анализируемом материале, при обнаружении химерного гена указывается, в какой доле проанализированных клеток он выявлен, исходя из чего определяется уровень достигнутого ответа (однако необходим анализ не менее 200 ядер):

Частичный и полный цитогенетические ответы соответствуют выраженному снижению Ph-позитивных клеток и определяются как большой цитогенетический ответ.

Что может влиять на результат?

Нарушения в проведении отдельных этапов исследования, опыт и квалификация врача молекулярно-генетической диагностики.

Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с обязательной микроскопией мазка крови)

Морфологическое исследование трепанобиоптата костного мозга

Мочевая кислота в сыворотке

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) общая

Кто назначает исследование?

Гематолог, онколог, терапевт, врач общей практики.

NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Chronic Myeloid Leukemia. Version 4.2018 – January 24, 2018. Available at www.nccn.org.

Источник

Трансформация генов или семь способов создать химеру

Продолжаем знакомить вас с тонкостями работы биотехнологов. Готовы поспорить, что каждый из чтецов этого текста слышал о генно-модифицированных организмах, сокращенно ГМО. Кто-то их боится, кто-то считает их спасением от глобальных проблем человечества, кому-то абсолютно все равно.

Однако мы готовы поспорить, что большая часть читателей даже не представляет, как на практике создают этих самых ГМО или, как их правильнее называть в среде ученых, трансгенных организмов и генетических химер.

Химера или химерный организм — организм, несущий в себе генетический материал, принадлежащий двум и более видам живых существ. Химерой может быть как многоклеточный организм, так и одноклеточный. Кроме того, различают химер по тому, насколько и в каком качестве присутствует чужеродный геном: заимствована ли часть генов, встроены ли они в хромосому реципиента, или же оба генома сохранены полностью, но располагаются в разных клетках. Впрочем, это тема для отдельного поста.

Итак, чтобы создать генетически модифицированный организм, надо изменить его геном. В научной среде изменение генома называется трансформацией.

Трансформация генов – это изменение генетического состава клеток путем привнесения извне чужеродного генетического материала, перенос чужеродных (природных или искусственно созданных) донорских генов в клетки-реципиенты растений, животных и микроорганизмов, и получение таким образом трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.

Секундное отступление. Трансформация — не изобретение человека. Бактерии умели передавать друг другу ДНК, захватывать чужую и встраивать ее в свой геном еще задолго даже до появления вирусов. Более того, эти свойства не утрачены даже у более развитых организмов. И, что еще более интересно, природная трансформация, также известная как горизонтальный перенос генов, играет огромную роль в эволюционных механизмах. Но это весьма обширная тема.

Стоит отметить, что трансформация имеет свои особенности для растений и животных. Растительные клетки из-за плотной клеточной стенки поверх мембраны неспособны самостоятельно поглощать фрагменты чужеродной ДНК и воспроизводить их, тогда как клетки животных могут различными способами поглощать фрагменты ДНК, встраивая их в свой геном, или поддерживать их воспроизведение в цитоплазме.

Исходя из этого учеными было разработано два основных метода генетической трансформации растений и еще пять – для животных. Разумеется, на самом деле их гораздо больше, однако по большей части это модификации основных семи. Рассмотрим вкратце каждый из них.

Векторный

По сути является лабораторной адаптацией механизма, называемого трансдукцией — обмен генами у бактерий и некоторых простейших. Пожалуй, он так же заслуживает отдельной статьи, но постараемся кратко.

Вектор — трансформирующий фактор, основой которого является самостоятельный фрагмент ДНК, несущий все необходимое для синтеза РНК и белка. Обычно на основе ДНК или РНК вируса, плазмиды или космиды (свободные генетические элементы бактерий и простейших).

В промышленной и сельскохозяйственной биотехнологии обычно создают векторы с помощью Ti-плазмид бактерий, так как они небольшие по объему, и относительно устойчивые.
Как их создают? Из плазмид выделяют участки Т-ДНК (транспортной), ответственные за встраивание в молекулу ДНК клетки-мишени и создают векторные ДНК (векторы), способные переносить и встраивать нужные последовательности, включая части, кодирующие нужный признак и вещество, а также маркеры (репортерные гены — они нужны для проверки — встроился ли вектор в ДНК реципиента).

Модифицированные агробактерии (или освобожденные плазмиды) помещают в одну среду с растительными клетками-реципиентами, откуда с помощью антибиотиков удаляют нетрансформированные клетки.

К векторной трансформации также относят перенос ДНК с помощью ретровирусов. Векторный перенос можно осуществить только при отсутствии клеточной стенки (т.е. необходимо привести клетку-донор в состояние протопласта).

Трансформированные клетки помещают в питательную среду для культивации (образование каллуса), впоследствии регенерируя из них целое растение.

Биобаллистический (Генный пистолет)

Биобаллистический или метод «генного пистолета» – применяют в основном в отношении однодольных растений, нечувствительных к агробактериям.

В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток-мишеней. Как вариант этого метода встречается магнетофекция – перенос с помощью намагниченных металлических частиц.

Векторный и биобаллистический методы универсальны и для растений, и для бактерий, и для животных. Теперь же переходим к методам, характерным для трансформации животных клеток. В принципе, их так же можно применить на растительных клетках, однако придется лишить их клеточной стенки, и знатно повозиться с подготовкой клетки.

Метод микроинъекций

Это самый простой способ внести ДНК в клетку. Вы часто видели его в научно-фантастических фильмах на тему утечки какого-нибудь патогена из секретной лаборатории.

Суть ее заключается во введении целевых генов непосредственно в ядро животной клетки при помощи микрокапиллярной пипетки. Под микроскопом в ядро клетки вводится 1 × 10^(−10)—1 × 10^(−12) л раствора трансформирующей ДНК (несколько тысяч копий генов).

Электропорация

Впервые была разработана в лаборатории Е. Неймана в 1982 т. для введения чужеродных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки.

В многочисленных опытах было показано, что обработка клеток животных электрическими импульсами с напряженностью поля 5-10 кВ/см в течение 5-10 мкс приводит к поглощению клетками молекул ДНК, находящихся в среде.

Липофекция

С чем-то подобным сталкиваются блюстители красоты, пользующиеся лосьонами с мицеллами и принимающие жирорастворимые витамины.

Липосомы (мицеллы, везикулы) — “пузырьки” из одного или двух слоев липидов, по свойствам схожих с естественной клеточной мембраной. В основном различают так: липосомы — двухслойные, содержат комплекс гликолипидов, мицеллы — однослойные, преимущественно липидные. Но это не точно:)

Липосомный (везикулярный) метод – пиноцитозное (захват раствора) поглощение метафазных хромосом, заключённых в синтетическую фосфолипидную оболочку (линохромосом или липоплекса). Изолированные метафазные хромосомы способны проникать в чужеродную клетку и функционировать в ней в течение некоторого времени.

Большая часть поглощенных хромосом деградирует, распадаясь на отдельные фрагменты, осуществляющие перенос содержащихся в них генов. Фрагменты могут существовать в свободном состоянии. Гены трансгенома функционируют наряду с другими своими хромосомными генами клетки. Такие популяции клеток называют нестабильными.

При постоянном действии генов трансгенома появляются стабильные популяции клеток (клоны) – когда сохранившийся фрагмент интегрируется с хромосомой клетки реципиента. Интеграция происходит не путем рекомбинаций через двойной кроссинговер, а через транслоцирование фрагментов на негомологичные участки генома реципиента.

Соматическая гибридизация

Слияние соматических клеток с объединением их геномов — образование гибридома. Производится электрическим, химическим и механическим путем. Частный случай гибридизации – использование микрокеток, иногда объединяют с липофекцией.

Введение с помощью микроклеток – клетки доноров обрабатываются таким образом, что часть хромосом или отдельные хромосомы оказываются заключенными в часть цитоплазмы. Слияние микроклетки донора с полноценной клеткой реципиента ведет к тому, что реципиент получает группу или отдельные хромосомы донора.

Это один из самых трудоемких методов создания трансформированных клеток. Однако он полностью оправдывает себя — так, например, производят антитела для лечения редких заболеваний, иммуноглобулины и создают из клеток больных раком пациентов индивидуальные лекарства.

Химическая преципитация

Метод несколько схож с генным пистолетом с той лишь разницей, что частицы ДНК не выстреливаются, а доставляются на соли.

Например, преципитация фосфатом кальция выглядит следующим образом. ДНК добавляют к смеси раствора СаСl2 и фосфатного буфера, ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция (Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Основные методы трансформации закончились. Познакомимся с редкими, но все же встречающимися — некоторые из них весьма любопытны.

Органическая преципитация. Катионные полимеры

По сути, гибрид химической преципитации и фагоцитоза. В основном используют ДЕАЕ-декстран. Преципитация диэтиламиноэтил-декстраном (ДЕАЕ-декстраном) – использование положительно заряженных (катионных) водорастворимых полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран, полиэтиленимин, поли-L-лизин или хитозан. Отрицательно заряженная ДНК связывает поликатионы, и образовавшийся положительно заряженный комплекс (полиплекс) взаимодействует с отрицательно заряженной мембраной клетки, что приводит к проникновению ДНК в клетку-мишень путем эндоцитоза. Метод считается малоэффективным из-за сложности с синтезом комплекса и слабом контроле доставки ДНК в ядро.

Фототрансфекция

Перенос фрагментов ДНК через поры, образованные в результате сверхкороткого облучения лазером. По сути, та же электропорация, только вместо тока — свет определенной длины волны.

Трансдукция

Вариация векторного метода для животных клеток. Имеет ряд отличий, например, в качестве вектора применяется фрагмент вирусной ДНК (ретровирусы, ДНК-вирусы, ВИЧ), чаще всего заключенный в реконструированную вирусную оболочку для облегчения проникновения в клетку и обеспечения тканеспецифичности.

Есть и еще менее популярные методы, как, например, трансформация тепловым шоком. Однако она сама по себе не привносит ДНК извне, лишь изменяя структуру существующей ДНК за счет температурных повреждений. Либо тепловой шок может служить тем же фактором повреждения мембраны, что и электрошок, открывая путь для проникновения ДНК. Но в таком случае, по сути он ничем не отличается от вышеназванных.

Итак, мы рассмотрели основные методы создания химерной (трансформированной) клетки или популяции клеток. Несмотря на то, что их характеристика по большей части уместилась в паре строк, каждый из них сопряжен с колоссальными усилиями как при подготовке, так и при исполнении, и тем более при контроле результата. Последнее особенно важно, так как любая клетка имеет свои механизмы защиты.

Мало трансформировать геном, надо еще обеспечить его сохранность и устойчивость — в противном случае, клетка быстро избавится от чужеродного фрагмента, вырезав его или растворив в лизосоме.

Для чего это делают?

На самом деле, трансформированные организмы давно уже нас окружают и служат нам. Стоит только подумать над тем, что первые научные работы на эту тему (на тему трансформации у бактерий) датированы до 1962 года, т.е. до подтверждения структуры ДНК! А сами бактериальные химеры стали применять аж в 1980-х.

Выше мы уже упоминали, что с помощью гибридов изготовляют лекарства от рака и редких заболеваний. Также с помощью трансформированных клеток производят гормоны (человеческий инсулин, ген которого перенесли в кишечную палочку), иммуноглобулины, белки, витамины (витамин С с помощью той же кишечной палочки, фитогормоны для растений с помощью сенной палочки), ферменты для пищевой, текстильной, химической промышленности, биоудобрения и биопрепараты для борьбы с паразитами и вредителями, антибиотики и даже очищают сахар (хотя это совсем уж редкий случай).

Вот вы узнали еще немного о биотехнологии.
Всего хорошего и не болейте!

Биотехнология: учебник и практикум для вузов / под редакцией Н. В. Загоскиной, Л. В. Назаренко. — 3-е изд., испр. и доп. — Москва: Издательство Юрайт, 2020. — 381 с.

Биотехнология / Т. Г. Волова. – Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. – 252 с

Биотехнология. Принципы и применение / Под ред. И.Хиггенса.- М.: Мир, 1980
Чечина, О. Н. Общая биотехнология: учебное пособие для вузов / О. Н. Чечина. — 2-е изд., перераб. и доп. — Москва: Издательство Юрайт, 2019. — 231 с.

Clough SJ, Bent AF. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43.

Godfrey J, Leukam MJ, Smith SM. An update in treating transformed lymphoma. Best Pract Res Clin Haematol. 2018 Sep;31(3):251-261.

Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V.,… Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. In Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Transfection. Protocols and Applications Guide. Promega.

Источник

Выявление и количественное определение мРНК химерного гена bcr-abl (р210) в Ливны

Лабораторный анализ основного маркера хронического миелоидного лейкоза.

Приём и исследование биоматериала

Когда нужно сдавать анализ Выявление и количественное определение мРНК химерного гена bcr-abl (р210)?

Подробное описание исследования

Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), или миелолейкоз, — клональное онкогенетическое заболевание, которое происходит из мутировавших злокачественных кроветворных — миелоидных — клеток костного мозга. На данный момент причины, по которым развивается миелолейкоз, не установлены. К факторам риска в основном относят инфекционные заболевания и радиационное облучение.

Для хронического миелоидного лейкоза характерны:

Ph, или филадельфийская хромосома, — это аномальная хромосома, которая возникает при обмене участков 9 и 22 хромосом. Данный обмен называют транслокацией, в результате неё возникает химерный онкоген BCR-ABL, который приводит к бесконтрольному росту клеток миелоидной линии (нейтрофилов, эозинофилов, базофилов и моноцитов). В норме избыточное кроветворение блокируется специфическими сигналами, однако аномальный белок BCR-ABL не воспринимает их. Со временем опухолевая масса вытесняет нормальные клетки кровяного ростка костного мозга.

При обмене участков 9 и 22 хромосом в местах обмена образуются разрывы. В зависимости от места разрыва могут быть разные транскрипты — генетические материалы в виде молекулы РНК — BCR-ABL. Основной транскрипт (мРНК) этого гена — p210. Данное исследование направлено на количественное определение именного этого варианта транскрипта BCR-ABL.

Клиническая картина хронического миелоидного лейкоза протекает в три фазы: хроническая, фаза акселерации и бластный криз. Заболевание начинается бессимптомно, затем появляется интоксикация и характерный синдром — гепатоспленомегалия (увеличение размеров печени и селезенки). В этот период в крови можно обнаружить избыточный уровень лейкоцитов. По мере прогрессирования болезни объем селезенки увеличивается в несколько раз, в крови выявляется анемия и низкий показатель тромбоцитов, а также появляются бластные клетки. Клинически у пациентов могут быть следующие симптомы:

Диагноз хронический миелолейкоз устанавливают при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), который количественно определяет мРНК BCR-ABL p210. Помимо этого, данный метод используют у пациентов с выявленным ХМЛ для оценки эффективности получаемого лечения, проводимого в основном таргетными препаратами — ингибиторами BCR/ABL тирозинкиназы.

Источник

Выявление и количественное определение мРНК химерного гена bcr-abl (р210) в Уржум

Лабораторный анализ основного маркера хронического миелоидного лейкоза.

Приём и исследование биоматериала

Когда нужно сдавать анализ Выявление и количественное определение мРНК химерного гена bcr-abl (р210)?

Подробное описание исследования

Для хронического миелоидного лейкоза характерны:

Источник

Белковая ловушка: как зеленые химеры «ловят» гены

Ася Хрущева, Наталья Дорогова, Светлана Федорова
«Природа» №8, 2018

Об авторах

Ася Сергеевна Хрущева — студентка магистратуры Новосибирского национального исследовательского государственного университета (НГУ). Занимается изучением деления соматических клеток, динамики цитоскелета.

Наталья Владимировна Дорогова — кандидат биологических наук, научный сотрудник сектора генетики клеточного цикла Федерального исследовательского центра «Институт цитологии и генетики» (ФИЦ ИЦиГ) СО РАН. Область научных интересов — визуализация внутриклеточных структур, митохондрии, программируемая клеточная гибель.

Светлана Александровна Фёдорова — кандидат биологических наук, заведующая сектором генетики клеточного цикла ФИЦ ИЦиГ СО РАН, старший преподаватель НГУ. Специалист в области биологии развития, исследует процессы формирования и функционирования гонад, взаимодействия генеративной и соматической тканей.

Ключевой механизм развития любого организма — динамическое изменение экспрессии его генов. Своевременное «включение» и «выключение» конкретных генов в определенных клетках вызывает их морфологические изменения, что проявляется во всем разнообразии живых организмов.

К настоящему времени разработано множество методов, позволяющих изучать экспрессию генов, измерять количество различных РНК в разных типах клеток, однако полное понимание функции гена невозможно без данных о пространственной и временной локализации его продукта. Частично эту проблему решает использование антител, которые специфично связываются с целевым белком, что позволяет определять его внутриклеточное местоположение или количество. Для использования антител необходимо иметь изучаемый белок или знать нуклеотидную последовательность кодирующего его гена, что не всегда возможно. Кроме того, антителами можно окрашивать только фиксированный материал, что существенно затрудняет анализ динамики распределения изучаемого белка.

Белковая ловушка

Рис. 1. Схема работы белковой ловушки (а) и ее модификаций (б, в). В ген внедряется искусственный мобильный элемент, содержащий белковую ловушку (зеленый участок — ДНК, кодирующая GFP; фиолетовые треугольники по краям — повторы от природного мобильного Р-элемента, которые необходимы для встраивания ловушки в геном). Зрелая матричная РНК данного гена включает в себя копию внедренной последовательности (зеленые участки). Продукт трансляции этой мРНК — соответствующий белок дикого типа (синий) с пришитой к нему флуоресцентной меткой (зеленая). При быстрой искусственной деградации целевых белков (б), содержащих GFP или любой другой флуоресцентный маркер, белковые Ub-метки связываются с GFP, после чего убиквитированный белок направляется в протеасому и деградирует (бледно-голубой с пунктирным контуром). При интерференции белковой ловушки IGFPi (в) двуцепочечные РНК (дцРНК, темно-зеленые), комплементарные последовательности gfp, связываются с матричной РНК, которая разрезается, вследствие чего белок не производится

Технология создания искусственных гибридных белков легла в основу современного метода белковой ловушки (дословный перевод с англ. — protein trap), который был разработан в 1996 г. для анализа локализации эндогенных (природных) белков [5]. Белковая ловушка содержит репортерный ген (как правило, gfp), который самостоятельно экспрессироваться не может. Этот искусственно созданный мобильный элемент запускают в ядро клетки, где он произвольно встраивается в геном. Если встройка произошла в межгенное пространство или в гены, которые кодируют РНК (например, гены рибосомной или транспортной РНК), или в ген в правильной ориентации, но со сдвигом кодона, то GFP будет «молчать» и эту линию мы в ходе анализа не заметим. Активация экспрессии gfp возможна только в случае встраивания генетического элемента в правильной ориентации (относительно начала гена) в ген, кодирующий белок, — отсюда и название «белковая ловушка» (рис. 1, а). Репортерный ген gfp в белковой ловушке не несет дополнительных последовательностей, регулирующих экспрессию, поэтому полученный химерный ген будет транскрибироваться в точности, как природный, т.е. его продукт будет нарабатываться на тех же стадиях и в тех же тканях. Так как ловушка — искусственная конструкция с полностью известной нуклеотидной последовательностью, можно относительно легко определить с точностью до нуклеотида, в какой именно ген произошла ее встройка, т.е. «поймать» при ее помощи гены с определенными особенностями экспрессии. Изучая локализацию химерных белков в клетках, можно вычленить гены, которые участвуют в каком-либо конкретном процессе (к примеру, определив белки, которые локализуются внутри митохондрий или на них, — получить список генов, продукты которых необходимы для поддержания структуры и функции митохондрий. Соответственно, белковую ловушку иногда называют ловушкой для генов.

Комбинирование флуоресцентного белка с изучаемым во многих случаях не приводит к изменению конформации и функции последнего, а свечение флуоресцентной «метки» позволяет определять его распределение в клетке. Гибридный GFP-белок от такого химерного гена в большинстве случаев будет иметь внутриклеточную локализацию, аналогичную природному. Полученный химерный белок и его внутриклеточное распределение можно изучать напрямую, по встроенной флуоресцентной метке (GFP), либо при помощи антител как к самому белку, так и к флуоресцентной метке. Таким образом, используя флуоресценцию, либо имея антитела только к GFP, можно изучить локализацию тысячи белков, поэтому метод белковой ловушки приобрел широкую популярность [3]. Кроме того, данный метод позволяет исследовать распределение гибридных белков непосредственно в живых клетках, что дает возможность не только наблюдать в реальном времени процессы, происходящие с участием GFP-гибридных молекул и их взаимодействие, но и использовать химерные белки в качестве различных внутриклеточных маркеров [3–6]. Применение таких гибридных маркеров позволяет изучать динамику процессов изменения морфологии и организации различных внутриклеточных структур в зависимости от стадии клеточного деления и дифференцировки [7]. В настоящее время получено множество модификаций белковых ловушек, содержащих различные флуоресцентные метки — YFP (от англ. yellow fluorescent protein — ‘желтый флуоресцентный белок’), Venus (модернизированный YFP), EYFP (от англ. enhanced yellow fluorescent protein — ‘усиленный желтый флуоресцентный белок’), RFP (от англ. red fluorescent protein — ‘красный флуоресцентный белок’) и др.

В некоторых случаях встраивание флуоресцентной метки все-таки изменяет конформацию нативного белка (например, если GFP нарушает целостность функционально значимого белкового домена) и получаемый химерный белок не обладает всеми функциями природного. Тем не менее, такой мутантный GFP-гибридный белок дает полную информацию о том, как экспрессия изучаемого гена зависит от ткани и стадии развития организма. Кроме того, остаются доступными инструменты исследования, разработанные на основе белковой ловушки: РНК-интерференция, FP-опосредованная деградация белков и т. д. Мутантный химерный белок не способен заменить природный, поэтому, наблюдая, как отражаются его дефекты на поведении других белков, органелл или клетки в целом, мы можем сделать выводы о функциях нативного белка. Иными словами, даже если встройка белковой ловушки окажется «неудачной», почти все преимущества данного метода сохраняются, а кроме того, мы дополнительно получаем мутацию гена, которую можем исследовать методами классической генетики.

Один из примеров использования белковой ловушки — визуализация мембран эндоплазматического ретикулума (ЭПР) с помощью гибридной формы дисульфид-изомеразы (Pdi, от англ. protein disulfide isomerase) — основного структурного белка ЭПР — и GFP-репортера. Химерный белок Pdi-GFP можно использовать для визуализации всех процессов, связанных с локализацией, перестройкой и метаболизмом ЭПР [12]. Например, в сперматогенезе дрозофилы происходят специфические изменения статуса ЭПР в зависимости от стадии клеточного деления и дифференцировки (рис. 2). Ретикулярная мембранная сеть, характерная для интерфазы (см. рис. 2, а), во время деления клеток замещается тубулярными мембранами, располагающимися между микротрубочками веретена (см. рис. 2, б). После мейоза, в самом начале дифференцировки спермиев, ЭПР окружает ядро и митохондрии, слившиеся в специфическую структуру, называемую небенкерном (см. рис. 2, в), затем, на стадии элонгации спермиев, ЭПР удлиняется согласованно с этими структурами (см. рис. 2, г). Окончание сперматогенеза характеризуется диссоциацией ЭПР на отдельные мембранные элементы и гранулы, которые удаляются из зрелых сперматозоидов (см. рис. 2, д).

Рис. 2. Визуализация динамики ЭПР (микрофотографии гибридного белка PdiGFP) на соответствующих стадиях сперматогенеза дрозофилы. Перед мейозом ЭПР равномерно распределена по цитоплазме (а), во время деления ретикулярная мембранная сеть замещается тубулярными мембранами, располагающимися между микротрубочками веретена (б). После мейоза начинается морфогенез сперматид (в). В это время ЭПР окружает ядро (на схеме слева выделено белым) и слившиеся в специфичную структуру митохондрии — небенкерн (показано черным). Во время роста хвостов сперматид (стадия элонгации) ЭПР удлиняется вместе с клеточной цитоплазмой (г), а во время индивидуализации и финального созревания сперматозоидов большая его часть будет удалена (д). На микрофотографиях синим светится хроматин, окрашенный DAPI, зеленым — белок GFP-Pdi. Длина масштабной линейки 10 мкм

С помощью GFP-гибридных мРНК-связывающих белков была выявлена пространственно-временная организация синтетических процессов в сперматогенезе дрозофилы [7]. Белки, участвующие в процессе созревания и локализации мРНК, разделились на три группы (рис. 3):

Рис. 3. Пространственно-временная организация синтетических процессов в сперматогенезе дрозофилы при помощи белков, участвующих в процессе созревания и локализации мРНК. Синий — хроматин, окрашенный DAPI, зеленый вверху слева — белок Rtc1-GFP, вверху справа — pAbp-GFP; внизу — Squid-GFP. Длина масштабной линейки 10 мкм

Распределение белков Squid и Hrb98DE в ядрах сперматоцитов морфологически сходно с распределением телец сплайсинга (splicing factor compartments). Белок RpL10Ab локализуется в цитоплазме; на стадии сперматоцита обнаруживается также гранула внутри ядра, с высокой вероятностью соответствующая ядрышковому организатору — области, где собираются субъединицы рибосомы. Белки Imp и Hrb98DE на стадии элонгации сперматид локализуются на особой структуре, которая отвечает за области наибольшей синтетической активности клеток на этой стадии развития.

Анализ места и стадий локализации гибридных белков помогает обнаруживать новые функции известных генов. Например, ранее считалось, что ген дрозофилы gilgamesh (gish), кодирующий синтез белка казеин-киназы-γ I, задействован только в дифференцировке глиальных клеток. Однако при изучении коллекции линий дрозофилы со встройками белковой ловушки мы установили, что эта протеинкиназа участвует также в метаболизме мембран во время сперматогенеза [13].

GFP-опосредованная РНК-интерференция

В результате встройки белковой ловушки в ген образуется матричная РНК, содержащая крайне специфичную последовательность gfp, которая не повторяется более ни в одном гене данного организма. На этом факте основан метод под названием «мишень-опосредованная потеря функции» (tagmediated loss-of-function), в котором в качестве мишени (тега) выступает РНК-последовательность gfp [14]. Если в клетку добавить малые двуцепочечные РНК, комплементарные участку gfp, то произойдет РНК-интерференция 4 (разрушение РНК), в результате чего перестанет нарабатываться продукт данного гена (см. рис. 1, в). Удобство проведения РНК-интерференции на основе белковой ловушки, названной IGFPi (от англ. in vivo GFP interference), состоит в том, что не требуются разработка и получение комплементарных малых РНК для каждого гена, который планируют «выключить», — достаточно использовать лишь РНК, комплементарную к gfp [15, [16]. Анализируя обширные коллекции организмов с GFP-белковыми ловушками, можно проводить интерференцию множества генов без создания дополнительных генетических конструкций.

Дополнительное преимущество использования интерференции на основе последовательности гена gfp из белковой ловушки — возможность определения эффективности самой РНК-интерференции. Обычно такие работы требуют проведения анализа количества РНК и белка в ткани, для которого необходимы антитела к исследуемому белку. Так как в случае белковой ловушки каждый гибридный белок содержит GFP-метку, можно одновременно оценивать интенсивность сигнала GFP в любой конкретной клетке или ткани, сравнивая линии с РНК-интерференцией против gfp и без, и делать выводы о проценте «выключения» гена, содержащего белковую ловушку [15].

Деградация FP-меченых белков

Белковая ловушка, содержащая любую флуоресцентную метку (FP), позволяет использовать антитела только к самой метке, не разрабатывая их к исследуемому белку. Это же преимущество было использовано для создания метода получения быстрой искусственной деградации целевых белков, содержащих GFP или любой другой флуоресцентный маркер (DeGradFP). Сконструированные белки, состоящие из фрагмента антител к GFP и лигазного домена белка SLMB дрозофилы, специфично узнают GFP и навешивают на такой химерный белок «цепочки» молекул убиквитина — Ub-метки (см. рис. 1, б) [17]. Их наличие служит сигналом для направления данного белка в протеасому и его последующей деградации. Система, регулирующая стабильность белков путем их убиквитинирования, эволюционно высококонсервативна, поэтому метод быстрой деградации GFP-меченых химерных белков работает в любых эукариотических клетках. Более того, Ub-метки подходят для других флуоресцентных ловушек, содержащих Venus, YFP, EYFP и т. д. Как и в случае РНК-интерференции, эффективность инактивации химерных белков через их деградацию можно оценивать по интенсивности их флуоресцентного сигнала. Во многих случаях это готовое к использованию решение, так как к настоящему времени существуют целые коллекции разных организмов с GFP-белковыми ловушками [17].

Модификации белковой ловушки iTRAC

В 2011 г. был разработан и описан новый подход — iTRAC (от англ. Integrase mediated trap conversion — ‘модификация интеграза-опосредованной ловушки’) [18]. Он позволяет адаптировать белковые ловушки, несущие специфические последовательности ДНК (сайты attP и attB), для различных целей с помощью относительно простой замены содержимого этих генетических конструкций, уже встроившихся в исследуемый ген (рис. 4). Данный подход основан на работе специального фермента (интегразы ϕС31), который катализирует рекомбинацию по attP и attB. После рекомбинации эти сайты изменяют свою нуклеотидную последовательность и перестают узнаваться интегразой, т.е. вторичный обмен происходить уже не может. Модифицированные ловушки содержат один или несколько сайтов attP, для замены содержимого такой ловушки используются вторичные конструкции, содержащие сайт(ы) attB. При активировании интегразы ϕС31 происходит рекомбинация участков ДНК между сайтами attР и attB, т.е. обмен содержимого ловушки и вторичной конструкции (см. рис. 4). Такой принцип обмена называется кассетным. Активировать интегразу ϕС31 можно повсеместно или только на интересующих нас стадиях развития или в отдельных клетках или органах, что существенно расширяет области ее применения. Например, внесение во вторичную ловушку стоп-кодона позволяет целенаправленно мутировать исследуемый ген и анализировать функции такого укороченного белка в конкретном типе клеток. А использование в первичной и вторичной ловушках флуоресцентных меток разного цвета — исследовать взаимодействие разных типов клеток в органах и тканях. Примером может служить ловушка, работающая на основе транспозона Minos, которая была разработана для визуализации физиологических процессов у разноногого рака Parhyale hawaiensis. Первичная ловушка содержала красный флуоресцентный маркер RFP, вторичная — зеленый GFP. Это позволило, ткане- или стадиеспецифически заменяя одну ловушку на другую, изучать различные системы органов данного организма, в частности проследить сердечную функцию, открытие и закрытие клапанов в деталях, которые ранее не были изучены [18].

Рис. 4. Схема работы iTRAC с двумя вариантами вторичных ловушек: содержащей красную флуоресцентную метку DsRED и содержащей стоп-кодон. Модифицированные белковые ловушки содержат по краям последовательности attP и attB (розовые). Интеграза ϕС31 катализирует рекомбинацию по сайтам attP и attB, и происходит обмен участками ДНК между сайтами attР и attB, т.е. содержимого ловушки, уже встроившейся в ген, и вторичной конструкции

Таким образом, первичная ловушка, содержащая последовательность attР, может быть реконструирована и использована вторично. Универсальность iTRAC позволяет использовать ее для самых различных целей: во-первых, для создания внутриклеточных маркеров для различных типов микроскопии; во-вторых, для внедрения систем, дающих возможность изменять экспрессию генов, используя вставку сильных терминаторов транскрипции; в-третьих, для введения в клетки генетических маркеров для определения различных типов клеток или для специфичного введения клеточного токсина только в клетки, содержащие первичную ловушку [18].

Данный подход универсален, так как интеграза работает во многих модельных организмах, включая дрозофилу, лягушек, мышей. Также для таких организмов уже существуют большие коллекции линий, содержащих ловушки, что позволяет разрабатывать и конструировать только вторичные конструкции, обмен материала с которыми требуется произвести.

Работа выполнена при поддержке Бюджетного проекта «Молекулярно-генетические основы регуляции экспрессии генов, морфологии, дифференцировки и перепрограммирования клеток» (проект 0324-2018-0019), а также Министерства образования и науки РФ по Программе повышения конкурентоспособности ведущих российских университетов среди ведущих мировых научно-образовательных центров (проект 5-100).

Литература
1. Shimomur O., Johnson F. H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell Comp. Physiol. 1962; 59(3): 223–239. DOI: 10.1002/jcp.1030590302.
2. Prasher D. C., Eckenrode V. K., Ward W. W. et al. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene. 1992; 111(2): 229–233. DOI: 1016/0378-1119(92)90691-H.
3. Степаненко О. В., Верхуша В. В., Кузнецова И. М. и др. Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии // Цитология. 2007; 49(5): 395–420.
4. Wang S., Hazelrigg T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis // Nature. 1994; 369: 400–403. DOI: 10.1038/369400a0.
5. Chudakov D. M., Matz M. V., Lukyanov S. A. et al. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues // Physiol. Rev. 2010; 90: 1103–1163. DOI: 10.1152/physrev.00038.2009.
6. Giepmans B., Adams S., Ellisman M. et al. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function // Science. 2006; 312: 217–224. DOI: 10.1126/science.1124618.
7. Nerusheva O. O., Dorogova N. V., Omelyanchuk L. V. GFP markers for studying D. melanogaster spermatogenesis // Cent. Eur. J. Biol. 2009; 4(4): 452–460. DOI: 10.2478/s11535-009-0052-y.
8. Kelso R. J. Buszczak M., Quiсones A. T. et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster // Nucleic. Acids. Res. 2004; 32(Database issue): D418–D420. DOI: 10.1093/nar/gkh014.
9. Morin X., Daneman R., Zavortink M. et al. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98(26): 15050e5. DOI: 10.1073/pnas.261408198.
10. Quiсones-Coello A. T., Petrella L. N., Ayers K. et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila // Genetics. 2007; 175(3): 1089–1104. DOI: 10.1534/genetics.106.065995.
11. Buszczak M., Paterno S., Lighthouse D. et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies // Genetics. 2007; 175(3): 1505–1531. DOI: 10.1534/genetics.106.065961.
12. Дорогова Н. В., Нерушева О. О., Омельянчук Л. В. и др. Изучение структурной организации и динамики эндоплазматического ретикулума в сперматогенезе Drosophila melanogaster с помощью гибридного белка Pdi-GFP // Биологические мембраны. 2009; 26(1): 50–57.
13. Nerusheva O. O., Dorogova N. V. et al. A GFP trap study uncovers the functions of Gilgamesh protein kinase in Drosophila melanogaster spermatogenesis // Cell Biology International. 2009; 33(5): 586–593. DOI: 10.1016/j.cellbi.2009.02.009.
14. Neumüller R. A., Wirtz-Peitz F., Lee S. et al. Stringent analysis of gene function and protein — protein interactions using fluorescently tagged genes // Genetics. 2012; 190(3): 931–940. DOI: 10.1534/genetics.111.136465.
15. Roignant J. Y., Carré C., Mugat B. et al. Absence of transitive and systemic pathways allows cell-specific and isoform-specific RNAi in Drosophila // RNA. 2003; 9(3): 299–308. DOI: 10.1261/rna.2154103.
16. Pastor-Pareja J. C., Xu Т. Shaping cells and organs in Drosophila by opposing roles of fat body-secreted collagen IV and perlecan // Dev. Cell. 2011; 21(2): 245–256. DOI: 10.1016/j.devcel.2011.06.026.
17. Caussinus E., Kanca O., Affolter M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody // Nat. Struct. Mol. Biol. 2011; 19: 117–121. DOI: 10.1038/nsmb.2180.
18. Kontarakis Z., Pavlopoulos A., Kiupakis A. et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms // Development. 2011; 138(12): 2625–2630. DOI: 10.1242/dev.066324.

1 Подробнее см.: Лабас Ю. А., Гордеева А. В., Фрадков А. Ф. Свет и цвет живых организмов: флуоресцирующие и цветные белки // Природа. 2003. № 3. С. 33–43.

2 Подробнее см.: Чудов С. В. Лауреаты Нобелевской премии 2008 года по химии — О. Симомура, М. Чалфи, Р. Цянь // Природа. 2009. № 1. С. 123–124.

4 Про явление РНК-интерференции — процесс подавления экспрессии гена при помощи малых молекул РНК — подробнее см.: Кленов М. С. Лауреаты Нобелевской премии 2008 года по физиологии или медицине — Э. Файер и К. Мэллоу // Природа. 2007. № 1. С. 76–79.

Источник